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1. PCR quantitative en temps réel

En 1996, la réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR en temps réel) a été introduite pour la première fois par Applied Biosystems aux États-Unis. La qPCR dite en temps réel fait référence à l'ajout de groupes fluorescents à la réaction de PCR pour surveiller en permanence le signal fluorescent. L'ordre d'apparition et le changement d'intensité du signal peuvent être utilisés pour analyser la quantité initiale du gène cible en temps réel. L'invention de cette technologie réalise le saut de la PCR qualitative à la PCR quantitative.

2. Produits chimiques utilisés dans la fluorescence PCR

À l'heure actuelle, la qPCR en temps réel est divisée en deux catégories: les colorants fluorescents et les sondes fluorescentes en fonction des différents produits chimiques fluorescents utilisés.

3. colorants utilisés dans la fluorescence PCR

Les colorants fluorescents sont également appelés colorants liant l'ADN. La principale molécule de colorant actuellement utilisée est le SYBR Green I. SYBR Green Je peux spécifiquement me lier à la rainure mineure de l'ADN double brin. Free SYBR Green I n'a presque pas de signal fluorescent, mais se lie à l'ADN double brin. Après cela, son signal de fluorescence peut être augmenté par des centaines de fois. Avec l'augmentation du produit PCR, la quantité de liaison du produit PCR et du colorant augmente également, et l'intensité du signal de fluorescence représente le nombre de molécules d'ADN double brin.

Les avantages des colorants fluorescents sont qu'ils sont faciles à utiliser, peuvent être combinés avec n'importe quel produit de PCR et sont peu coûteux.

En général, la méthode SYBR Green I est l'une des expériences qPCR en temps réel les plus basiques et les plus couramment utilisées.

4. Sondes pour la fluorescence PCR

The most commonly used fluorescent probes in Real-time qPCR are TaqMan probes. The basic principle is to design and synthesize a probe that can specifically hybridize to the target gene. The 5' end of the probe is labeled with a fluorophore, and the 3' end is labeled with a quencher group.

Dans des circonstances normales, la distance spatiale entre les deux groupes est très proche et le gène fluorescent ne peut pas fluorescer en raison de l'extinction. Pendant l'amplification par PCR, l'amorce et la sonde se lient au gabarit en même temps, et la position de liaison de la sonde est située entre les amorces amont et aval.

When the amplification extends to the position where the probe binds, the Taq enzyme uses the 5' exonuclease activity to cleave the fluorescent molecule attached to the 5' end of the probe from the probe, causing it to fluoresce. The number of detected fluorescent molecules is proportional to the number of PCR products, therefore, the number of initial DNA templates can be calculated according to the fluorescence intensity in the PCR reaction system.

La technologie de sonde TaqMan résout le problème de la combinaison de colorants fluorescents et d'amplification non spécifique. Après la réaction, il n'y a pas besoin de la détection de la courbe de fusion, ce qui raccourcit le temps de test.

Les avantages de la technologie de sonde de TaqMan sont bas fond de fluorescence, sensibilité élevée, stabilité élevée d'hybridation, bonne résolution spectrale de fluorescence, et spécificité élevée.

En raison de la haute spécificité des sondes TaqMan, il peut être utilisé pour la discrimination allélique, en particulier pour les polymorphismes des gènes humains et pour distinguer et quantifier les souches basées sur SNP.